食品安全事件的頻頻發(fā)生，使得民眾對食品安全問題越來越關(guān)注。為了確保食品安全，政府部門除了要出臺相關(guān)法律法規(guī)外，更為重要的是要建立起更為科學(xué)的食品安全性的檢測技術(shù)。規(guī)范的檢測方法是有效保障食品安全的重要環(huán)節(jié)，它要求檢驗數(shù)據(jù)具有更高的準(zhǔn)確度和可信度。食品中菌落總數(shù)反映了食品在生產(chǎn)過程中的衛(wèi)生情況，體現(xiàn)食品被細(xì)菌污染的程度，是做出科學(xué)衛(wèi)生評價的重要指標(biāo)之一。本文主要對國標(biāo)法微生物檢測中菌落總數(shù)測定采用的傳統(tǒng)方法即平板計數(shù)法的注意事項進(jìn)行相關(guān)的分析，并著重介紹了快速檢測技術(shù)在菌落總數(shù)檢測中的應(yīng)用。
傳統(tǒng)檢測方法
一、傳統(tǒng)檢測方法的流程圖
注意事項
國標(biāo)法測菌群總數(shù)是以檢樣中的細(xì)菌細(xì)胞和營養(yǎng)瓊脂混合后，每個細(xì)菌細(xì)胞都能形成一個可見的單獨菌落的假定為基礎(chǔ)的。由于檢驗中采用37℃于有氧條件下培養(yǎng)(空氣中含氧約20％)，因而并不能測出每g或mL檢樣中實際的總活菌數(shù)，厭氧菌、微嗜氧菌和冷營菌在此條件下不生長，有特殊營養(yǎng)要求的一些細(xì)菌也受到了限制，因此所得結(jié)果，只包括一群能在普通營養(yǎng)瓊脂中發(fā)育、嗜中溫的、需氧和兼性厭氧的細(xì)菌菌落的總數(shù)。國標(biāo)法檢測應(yīng)注意以下問題：
1.所用器皿及稀釋液
（1）檢驗中所用玻璃器皿，如培養(yǎng)皿，吸管、試管等必須是完全滅菌的，并在滅菌前徹底洗滌干凈，不得殘留有抑菌物質(zhì)。
（2）用作樣品稀釋的液體，每批都要有空白對照。如果在瓊脂對照平板上出現(xiàn)幾個菌落時，要追加對照平板，以判定是空白稀釋液，用于傾注平皿的培養(yǎng)基，還是平皿吸管或空氣可能存在的污染。
（3）檢樣的稀釋液雖可用滅菌鹽水或蒸餾水，但以用磷酸緩沖鹽水特別是0.1％蛋白胨水為合適，因蛋白胨水對細(xì)菌細(xì)胞有更好的保護作用，不會因為在稀釋過程中而使食品檢樣中原已受損傷的細(xì)菌細(xì)胞導(dǎo)致死亡。如果對含鹽量較高的食品(如，醬品等)進(jìn)行稀釋，則需采用蒸餾水。
2.樣品稀釋
（1）檢樣稀釋時,無菌稱取(或量取)有代表性的樣品25g(或mL)剪碎放于含有225mL滅菌稀釋液的玻璃瓶內(nèi)(瓶內(nèi)預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的玻璃珠)，經(jīng)充分振搖作成1:10的稀釋液。制備10倍系列稀釋的樣品勻液時，每一步都應(yīng)該搖勻試管或反復(fù)吹吸，使菌體能夠盡量分散均勻。如系肉、魚等固體樣品，最好剪細(xì)于滅菌乳缽內(nèi)與稀釋液研勻，或與稀釋液同置于滅菌均質(zhì)器杯中，以8000～10000rpm速度攪拌1分鐘，使做成均勻的1：10稀釋液。對于像食醋或酸性飲料等酸度較高的樣品，如果直接用原樣液來檢測菌落總數(shù)，結(jié)果會偏低甚至為0，只有嚴(yán)格按標(biāo)準(zhǔn)要求先用滅菌的20～30%碳酸鈉溶液將其PH值調(diào)至中性后方可準(zhǔn)確檢測出菌落總數(shù)[3]。
（2）根據(jù)食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)要求或?qū)?biāo)本污染情況的估計，將上述1：10的檢樣稀釋液再做成幾個適當(dāng)?shù)?0倍遞增稀釋液。即取1：10稀釋液1mL與9mL稀釋液混和做成1:100的稀釋液，然后依次遞增稀釋，做成1：1 000、1：10000等稀釋液。注意每遞增稀釋一次，必須另換1支1mL滅菌吸管，這樣所得檢樣的稀釋倍數(shù)方為準(zhǔn)確。
（3）從吸管筒內(nèi)取出滅菌吸管時，不要將吸管尖端碰著其他仍留在容器內(nèi)的吸管的外露部分;；而且吸管在進(jìn)出裝有稀釋液的玻璃瓶和試管時，也不要觸及瓶口及試管口的外側(cè)部分；因為這些部分都可能接觸過手或其他沾污物。
（4）在作10倍遞增稀釋中，吸管插入檢樣稀釋液內(nèi)不能低于液面2.5cm；吸入液體時，應(yīng)先高于吸管刻度，然后提起吸管尖端離開液面，將尖端貼于玻璃瓶或試管的內(nèi)壁使吸。管內(nèi)液體調(diào)至所要求的刻度，這樣取樣較準(zhǔn)確，而且在吸管從稀釋液內(nèi)取出時不會有多余的液體粘附于管外。
（5）當(dāng)用吸管將檢樣稀釋液加至另一裝有9mL空白稀釋液的試管內(nèi)時，應(yīng)小心沿管壁加入，不要觸及管內(nèi)稀釋液，以防吸管尖端外側(cè)部分粘附的檢液也混入其中。
3．平板接種與培養(yǎng)
（1）將稀釋液加至滅菌平皿內(nèi)時，應(yīng)根據(jù)食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)要求或?qū)?biāo)本污染情況的估計，選擇2～3個適宜稀釋度，分別在作10倍遞增稀釋的同時，即以吸取該稀釋度的吸管移lmL稀釋液加入皿內(nèi)(從皿側(cè)加入，不要揭去皿蓋)，最后將吸管直立使液體流畢，并在皿底干燥處再擦一下吸管尖將余液排出，而不要吹出。每個稀釋度應(yīng)作2個平皿。
（2）培養(yǎng)溫度，應(yīng)根據(jù)食品種類而定。肉、乳、蛋類食品用37℃培養(yǎng)，水產(chǎn)品用30℃培養(yǎng)。培養(yǎng)時間為48±2h。其他食品，如清涼飲料，調(diào)味品，糖果、糕點．果脯，酒類(主要為發(fā)酵酒)、豆制品和醬腌萊均系用37℃24±2h培養(yǎng)。培養(yǎng)溫度和時間之所以有這種不同的區(qū)分，是因為在制定這些食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)中關(guān)于菌落總數(shù)的規(guī)定時，分別采用了不同的溫度和培養(yǎng)時間所取得的數(shù)據(jù)之故。水產(chǎn)品因來自淡水或海水，水底溫度較低，因而制定水產(chǎn)品細(xì)菌方面的衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)時，系用30℃作為培養(yǎng)的溫度。
4. 菌落計數(shù)
（1）在進(jìn)行菌落計數(shù)時，有一些樣品的殘渣會在視覺上與菌落混淆，因此，在進(jìn)行計數(shù)時應(yīng)該仔細(xì)分辨。菌落的形狀相對規(guī)則，比較有光澤度，更飽滿，而樣品的殘渣比較不規(guī)則，沒有菌落的飽滿度和光澤度。另外，還可向培養(yǎng)基中添加一定濃度的TTC，可以使菌落成紅色，便于觀測和計數(shù)，但TTC的濃度不宜過高，否則會抑制菌落的生長。
（2）從溫箱內(nèi)取出平皿進(jìn)行菌落計數(shù)時，應(yīng)先分別觀察同一稀釋度的兩個平皿和不同稀釋度的幾個平皿內(nèi)平板上菌落生長情況。平行試驗的2個平板與菌落數(shù)應(yīng)該接近，不同稀釋度的幾個平板上菌落數(shù)則應(yīng)與檢樣稀釋倍數(shù)成反比，即檢樣稀釋倍數(shù)越大，菌落數(shù)越低，稀釋倍數(shù)越小，菌落數(shù)越高。
（3）菌落計數(shù)所得結(jié)果，可分別按以下幾種不同情況作報告。
①若1個稀釋度的平均菌落數(shù)在30～300之間，則將該菌落數(shù)乘其稀釋倍數(shù)報告之。
②若有兩個稀釋度，其生長的菌落數(shù)均在30～300之間，則視二者之比如何來決定。若其比值小于2，應(yīng)報告其平均數(shù)。
③若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均大于300，則應(yīng)按稀釋度最高的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告之。
④若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均小于30，則應(yīng)按稀釋度最低的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告之。
快速檢測新技術(shù)
1. 3M測試片快速分析技術(shù)
3M測試片法是一種便捷可再生水化干膜，適用于細(xì)菌和真菌的計數(shù)。
檢測步驟
只需三步就可實現(xiàn)快速準(zhǔn)確的測定。
(以大腸桿菌的為例)
結(jié)果判讀
①測試片中含有一種紅色指示染劑可使菌落著色，計算所有紅色菌落(不論其大小和顏色深淺均計算之)。
②測試片上沒有任何菌落生長。
③有不多的菌落。
④測試片菌落數(shù)適宜計數(shù)范圍是25～250。
⑤測試片面積約為20平方厘米，當(dāng)菌落數(shù)超過250個，如5所示，為了估計菌落數(shù)，可選擇其中一個或數(shù)個有代表性菌落的小方格(1cm2)，計算平均菌落數(shù)，再乘以20可得到整個測試片上的菌落數(shù)。
⑥ 測試片上菌落太多而無法計數(shù)。
⑦有很多高數(shù)量菌落，使整個生長區(qū)變粉色，應(yīng)計錄為菌落太多無法計數(shù)。
⑧有時菌落分布出現(xiàn)不均衡，如8所示,這也記錄為菌落太多無法計數(shù)。
⑨測試片上的菌落,最先粗略一看是可計數(shù)的，然而，你密切注意到生長區(qū)邊緣，能看到高密度的菌落，應(yīng)記錄為菌落太多無法計數(shù)。
測試片法特點
（1）工作效率的極大提高
根據(jù)大量數(shù)據(jù)統(tǒng)計，使用3M測試片技術(shù)，可以提高實驗室工作效率118%以上。勞動資源的最佳使用帶來生產(chǎn)能力的提高，最終的效果就是效益的增加。
（2）標(biāo)準(zhǔn)化的檢測方法
品質(zhì)穩(wěn)定的快速測試片克服了傳統(tǒng)的測試方法存在的由于使用不同批次的培養(yǎng)基，不同的配制條件，不同配制人員而導(dǎo)致的差異性。
（3）國際化的認(rèn)證方法
3M快速測試的方法得到包括AOAC，AFNOR 在內(nèi)的國際權(quán)威機構(gòu)的認(rèn)證，在全球許多國家也已獲得官方機構(gòu)的正式批準(zhǔn)，從而可以確保檢測結(jié)果的可靠性和在世界各地的廣泛認(rèn)可。
（4）快速得到檢測結(jié)果
對比傳統(tǒng)的測試方法，3M快速測試片縮短檢測時間，使您在更短的時間內(nèi)獲得樣品的測試結(jié)果，能更加迅速地采取有效的措施解決發(fā)現(xiàn)的問題。
（5）方便進(jìn)行HACCP認(rèn)證
由于檢測速度快，檢測項目全，準(zhǔn)確性高。3M為食品生產(chǎn)工藝過程中關(guān)鍵控制點的監(jiān)控提供了較為完整的系列產(chǎn)品，可以對包括生產(chǎn)線，生產(chǎn)設(shè)備和環(huán)境在內(nèi)的各個環(huán)節(jié)進(jìn)行全面的測試。
2. ATP法
ATP熒光法檢測總菌落數(shù)原理
螢火蟲會發(fā)光是由于它能合成將化學(xué)物質(zhì)的化學(xué)能轉(zhuǎn)變?yōu)楣饽艿纳锎呋瘎?mdash;熒光素酶、蟲熒光素（D-luciferin）以及所有細(xì)胞生物都產(chǎn)生的生物能量物質(zhì)—三磷酸腺苷（ATP）。在有氧的條件下，蟲光素酶催化蟲熒光素和ATP之間發(fā)生氧化反應(yīng)，形成氧化熒光素并發(fā)出熒光，其生化反應(yīng)式如下：
ATP法特點：
（1）具有成本低，操作簡單，響應(yīng)速度快等特點，
（2）微生物ATP生物發(fā)光法在國外已被廣泛地運用于食品中菌落總數(shù)的測定。
3. MTT法
MTT法檢測原理
檢測原理為活體微生物線粒體中含有琥珀酸脫氫酶，能使外源性MTT（噻唑藍(lán)）還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲臜（Formazan）并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無此功能。Formazan結(jié)晶形成的量與活菌數(shù)成正比。用酶聯(lián)免疫檢測儀在490nm波長處測定其光吸收值，可間接反映活菌細(xì)胞數(shù)量。
應(yīng)用實例：
巴氏消毒奶中活菌素快速檢測
取巴斯消毒奶10mL ，至于無菌離心管中3000rpm離心5分鐘，棄去上清。加入10mL無菌生理鹽水洗滌離心管，再次3000 rpm離心5分鐘，棄去上清取出奶液基質(zhì)。加入1mL生理鹽水重懸底部的微生物，取0.2mL到96孔酶標(biāo)板中，同時加入標(biāo)準(zhǔn)菌液做標(biāo)準(zhǔn)曲線，統(tǒng)一加入底物反應(yīng)30分鐘，讀數(shù)。
該方法的特點：
檢測快速，靈敏度高。
4. 流式細(xì)胞術(shù)
檢測原理：
細(xì)胞經(jīng)特異熒光素標(biāo)記后，通過激光照射，產(chǎn)生特異熒光信號，通過對這些熒光信號的檢測和定量計算出菌群總數(shù)。
特點：
快速、便捷結(jié)果可靠、便于操作。
小結(jié)
菌落總數(shù)是微生物檢測中最常見的項目，在檢驗的每一個環(huán)節(jié)都應(yīng)該小心謹(jǐn)慎，精準(zhǔn)操作，確保檢測結(jié)果的準(zhǔn)確度。國標(biāo)法采用的平板計數(shù)法是我們最常用的檢測方法，但是操作過程較為復(fù)雜，時間較長；而其他方法操作簡便，省時，但是有的成本相對較高，并且有的只針對特定的食品種類。我們應(yīng)該積極關(guān)注新的科學(xué)技術(shù)在檢測方法中的應(yīng)用，讓檢測更加精確、經(jīng)濟、便捷和可靠。
