各種微生物由于遺傳特性不同，因此適合采用的保藏方法也不一樣。一種良好的有效保藏方法，首先應(yīng)能保持原菌種的優(yōu)良性狀長(zhǎng)期不變，同時(shí)還須考慮方法的通用性、操作的簡(jiǎn)便性和設(shè)備的普及性。ATCC菌株小編下面介紹幾種常用的菌種保藏方法：
（一）斜面低溫保藏法
將菌種接種在適宜的斜面培養(yǎng)基上，待菌種生長(zhǎng)完全后，置于4℃左右的冰箱中保藏，每隔一定時(shí)間（保藏期）再轉(zhuǎn)接至新的斜面培養(yǎng)基上，生長(zhǎng)后繼續(xù)保藏，如此連續(xù)不斷。
此法廣泛適用于細(xì)菌、放線菌、酵母菌和霉菌等大多數(shù)微生物菌種的短期保藏及不宜用冷凍干燥保藏的菌種。放線菌、霉菌和有芽孢的細(xì)菌一般可保存6個(gè)月左右，無(wú)芽孢的細(xì)菌可保存1個(gè)月左右，酵母菌可保存3個(gè)月左右。如以橡皮塞代替棉塞，再用石蠟封口，置于4℃冰箱中保藏，不僅能防止水分揮發(fā)、能隔氧，而且能防止棉塞受潮而污染。這一改進(jìn)可使菌種的保藏期延長(zhǎng)。
此法由于采用低溫保藏，大大減緩了微生物的代謝繁殖速度，降低突變頻率；同時(shí)也減少了培養(yǎng)基的水分蒸發(fā)，使其不至于干裂。該法的優(yōu)點(diǎn)是簡(jiǎn)便易行，容易推廣，存活率高，故科研和生產(chǎn)上對(duì)經(jīng)常使用的菌種大多采用這種保藏方法。其缺點(diǎn)是菌株仍有一定程度的代謝活動(dòng)能力，保藏期短，傳代次數(shù)多，菌種較容易發(fā)生變異和被污染。
（二）石蠟油封藏法
此法是在無(wú)菌條件下，將滅過(guò)菌并已蒸發(fā)掉水分的液體石蠟倒入培養(yǎng)成熟的菌種斜面（或半固體穿刺培養(yǎng)物）上，石蠟油層高出斜面頂端lcm，使培養(yǎng)物與空氣隔絕，加膠塞并用固體石蠟封口后，垂直放在室溫或4℃冰箱內(nèi)保藏。使用的液體石蠟要求優(yōu)質(zhì)無(wú)毒，化學(xué)純規(guī)格，其滅菌條件是：150～170℃烘箱內(nèi)滅菌lh；或121℃高壓蒸汽滅菌60～80min，再置于80℃的烘箱內(nèi)烘干除去水分。
由于液體石蠟阻隔了空氣，使菌體處于缺氧狀態(tài)下，而且又防止了水分揮發(fā)，使培養(yǎng)物不會(huì)干裂，因而能使保藏期達(dá)1～2年，或更長(zhǎng)。
這種方法操作簡(jiǎn)單，它適于保藏霉菌、酵母菌、放線菌、好氧性細(xì)菌等，對(duì)霉菌和酵母菌的保藏效果較好，可保存幾年，甚至長(zhǎng)達(dá)10年。但對(duì)很多厭氧性細(xì)菌的保藏效果較差，尤其不適用于某些能分解烴類的菌種。
有試驗(yàn)指出，此法用于保藏紅曲霉很合適，保藏1～2年后存活率為100％；也有報(bào)道顯示，某些蕈菌菌絲用石蠟油保藏法，在3～6℃保藏時(shí)菌絲易于死亡，而在室溫下反而較理想，這是值得注意的。
（三）砂土管保藏法
這是一種常用的長(zhǎng)期保藏菌種的方法，適用于產(chǎn)孢子的放線菌、霉菌及形成芽孢的細(xì)菌，對(duì)于一些對(duì)干燥敏感的細(xì)菌如奈氏球菌、弧菌和假單胞桿菌及酵母則不適用。
其制作方法是，先將砂與土分別洗凈、烘干、過(guò)篩(一般砂用60目篩，土用120目篩)，按砂與土的比例為(1～2)：1混勻，分裝于小試管中，砂土的高度約1cm，以121℃蒸汽滅菌1～1.5h，間歇滅菌3次。50℃烘干后經(jīng)檢查無(wú)誤后備用。也有只用砂或土作載體進(jìn)行保藏的。需要保藏的菌株先用斜面培養(yǎng)基充分培養(yǎng)，再以無(wú)菌水制成108～1010個(gè)/ml菌懸液或孢子懸液滴入砂土管中，放線菌和霉菌也可直接刮下孢子與載體混勻，而后置于干燥器中抽真空約2～4h，用火焰熔封管口(或用石蠟封口)，置于干燥器中，在室溫或4℃冰箱內(nèi)保藏，后者效果更好。
砂土管法兼具低溫、干燥、隔氧和無(wú)營(yíng)養(yǎng)物等諸條件，故保藏期較長(zhǎng)、效果較好，且微生物移接方便，經(jīng)濟(jì)簡(jiǎn)便。它比石蠟油封藏法的保藏期長(zhǎng)，約1～10年。中國(guó)科學(xué)院微生物研究所用砂土管保藏法保藏放線菌。
（四）麩皮保藏法
麩皮保藏法亦稱曲法保藏。即以麩皮作載體，吸附接入的孢子，然后在低溫干燥條件下保存。其制作方法是按照不同菌種對(duì)水分要求的不同將麩皮與水以一定的比例1：(0.8～1.5)拌勻，裝量為試管體積2/5，濕熱滅菌后經(jīng)冷卻，接入新鮮培養(yǎng)的菌種，適溫培養(yǎng)至孢子長(zhǎng)成。將試管置于盛有氯化鈣等干燥劑的干燥器中，于室溫下干燥數(shù)日后移入低溫下保藏；干燥后也可將試管用火焰熔封，再保藏，則效果更好。
此法適用于產(chǎn)孢子的霉菌和某些放線菌，保藏期在1年以上。因操作簡(jiǎn)單，經(jīng)濟(jì)實(shí)惠，工廠較多采用。中國(guó)科學(xué)院微生物研究所采用麩皮保藏法保藏曲霉，如米曲霉、黑曲霉、泡盛曲霉等，其保藏期可達(dá)數(shù)年至數(shù)十年。
（五）甘油懸液保藏法
此法是將菌種懸浮在甘油蒸餾水中，置于低溫下保藏，本法較簡(jiǎn)便，但需置備低溫冰箱。保藏溫度若采用-20℃，保藏期約為0.5～1年，而采用-70℃，保藏期可達(dá)10年。
將擬保藏菌種對(duì)數(shù)期的培養(yǎng)液直接與經(jīng)121℃蒸汽滅菌20min的甘油混合，并使甘油的終濃度在10％～15％，再分裝于小離心管中，置低溫冰箱中保藏?；蚬こ叹２捎帽痉ū２?。
（六）冷凍真空干燥保藏法
冷凍真空干燥保藏法又稱冷凍干燥保藏法，簡(jiǎn)稱凍干法。它通常是用保護(hù)劑制備擬保藏菌種的細(xì)胞懸液或孢子懸液于安瓿管中，再在低溫下快速將含菌樣凍結(jié)，并減壓抽真空，使水升華將樣品脫水干燥，形成完全干燥的固體菌塊。并在真空條件下立即融封，造成無(wú)氧真空環(huán)境，最后置于低溫下，使微生物處于休眠狀態(tài)，而得以長(zhǎng)期保藏。常用的保護(hù)劑有脫脂牛奶、血清、淀粉、葡聚糖等高分子物質(zhì)。
由于此法同時(shí)具備低溫、干燥、缺氧的菌種保藏條件，因此保藏期長(zhǎng)，一般達(dá)5～15年，存活率高，變異率低，是目前被廣泛采用的一種較理想的保藏方法。除不產(chǎn)孢子的絲狀真菌不宜用此法外，其他大多數(shù)微生物如病毒、細(xì)菌、放線菌、酵母菌、絲狀真菌等均可采用這種保藏方法。但該法操作比較煩瑣，技術(shù)要求較高，且需要凍干機(jī)等設(shè)備。
保藏菌種需用時(shí)，可在無(wú)菌環(huán)境下開(kāi)啟安瓿管，將無(wú)菌的培養(yǎng)基注入安瓿管中，固體菌塊溶解后，搖勻復(fù)水，然后將其接種于適宜該菌種生長(zhǎng)的斜面上適溫培養(yǎng)即可。
（七）液氮超低溫保藏法
液氮超低溫保藏法簡(jiǎn)稱液氮保藏法或液氮法。它是以甘油、二甲基亞砜等作為保護(hù)劑，在液氮超低溫（-196℃）下保藏的方法。其主要原理是菌種細(xì)胞從常溫過(guò)渡到低溫，并在降到低溫之前，使細(xì)胞內(nèi)的自由水通過(guò)細(xì)胞膜外滲出來(lái)，以免膜內(nèi)因自由水凝結(jié)成冰晶而使細(xì)胞損傷。美國(guó)ATCC菌種保藏中心采用該法時(shí)，把菌懸液或帶菌絲的瓊脂塊經(jīng)控制致冷速度，以每分鐘下降1℃/min 的速度從0℃直降到-35℃，然后保藏在-150℃～-196℃液氮冷箱中。如果降溫速度過(guò)快，由于細(xì)胞內(nèi)自由水來(lái)不及滲出胞外，形成冰晶就會(huì)損傷細(xì)胞。據(jù)研究認(rèn)為降溫的速度控制在(1～10)℃/min，細(xì)胞死亡率低；隨著速度加快，死亡率則相應(yīng)提高。
液氮低溫保藏的保護(hù)劑，一般是選擇甘油、二甲基亞砜、糊精、血清蛋白、聚乙烯氮戊環(huán)、吐溫80等，但最常用的是甘油（10%～20%）。不同微生物要選擇不同的保護(hù)劑，再通過(guò)試驗(yàn)加以確定保護(hù)劑的濃度，原則上是控制在不足以造成微生物致死的濃度。
此法操作簡(jiǎn)便、高效、保藏期一般可達(dá)到15年以上，是目前被公認(rèn)的最有效的菌種長(zhǎng)期保藏技術(shù)之一。除了少數(shù)對(duì)低溫?fù)p傷敏感的微生物外，該法適用于各種微生物菌種的保藏，甚至連藻類、原生動(dòng)物、支原體等都能用此法獲得有效的保藏。此法的另一大優(yōu)點(diǎn)是可使用各種培養(yǎng)形式的微生物進(jìn)行保藏，無(wú)論是孢子或菌體、液體培養(yǎng)物或固體培養(yǎng)物均可采用該保藏法。其缺點(diǎn)是需購(gòu)置超低溫液氮設(shè)備，且液氮消耗較多，操作費(fèi)用較高。
要使用菌種時(shí)，從液氮罐中取出安瓿瓶，并迅速放到35～40℃溫水中，使之冰凍熔化，以無(wú)菌操作打開(kāi)安瓿瓶，移接到保藏前使用的同一種培養(yǎng)基斜面上進(jìn)行培養(yǎng)。從液氮罐中取出安瓿瓶時(shí)速度要快，一般不超過(guò)1min，以防其他安瓿瓶升溫而影響保藏質(zhì)量。并且取樣時(shí)一定要戴專用手套以防止意外爆炸和凍傷。
（八）宿主保藏法
此法適用于專性活細(xì)胞寄生微生物（如病毒、立克次氏體等）。它們只能寄生在活的動(dòng)植物或其他微生物體內(nèi)，故可針對(duì)宿主細(xì)胞的特性進(jìn)行保存。如植物病毒可用植物幼葉的汁液與病毒混合，冷凍或干燥保存。噬菌體可以經(jīng)過(guò)細(xì)菌培養(yǎng)擴(kuò)大后，與培養(yǎng)基混合直接保存。動(dòng)物病毒可直接用病毒感染適宜的臟器或體液，然后分裝于試管中密封，低溫保存。
在上述的菌種保藏方法中，以斜面低溫保藏法、石蠟油封藏法、宿主保藏法最為簡(jiǎn)便，砂土管保藏法、麩皮保藏法和甘油懸液保藏法次之；以冷凍真空干燥保藏法和液氮超低溫保藏法最為復(fù)雜，但其保藏效果最好。應(yīng)用時(shí)，可根據(jù)實(shí)際需要選用。
在國(guó)際著名的“美國(guó)典型培養(yǎng)物收藏中心”(簡(jiǎn)寫(xiě)ATCC)，僅采用兩種最有效的保藏法，即保藏期一般達(dá)5～15年的冷凍真空干燥保藏法與保藏期一般達(dá)15年以上的液氮超低溫保藏法，以達(dá)到最大限度地減少傳代次數(shù)，避免菌種變異和衰退的目的。我國(guó)菌種保藏多采用3種方法，即斜面低溫保藏法、液氮超低溫保藏法和冷凍真空干燥保藏法。
