五、寄主保存法：
即令微生物侵入其寄主后加以保存的方法。用于目前尚不能在人工培養(yǎng)基上生長的微生物，如病毒、立克次氏體、螺旋體等，它們必須在生活的動物、昆蟲、雞胚內(nèi)感染并傳代，此法相當于一般微生物的傳代培養(yǎng)保藏法。病毒等微生物亦可用其他方法如液氮保藏法與冷凍干燥保藏法進行保藏。
六、冷凍保存法：
適用于抗凍力強的微生物。這些微生物可在其菌體細胞外遭受凍結的情況下而不受損傷，而對其它大多數(shù)微生物而言，無論在細胞外凍結還是在細胞內(nèi)凍結，都會對菌體造成損傷，當采用這種保藏方法時，應注意以下幾點：
①要選擇適于冷凍干燥的菌齡細胞。
②要選擇適宜的培養(yǎng)基，因為某些微生物對冷凍的抵抗力，常隨培養(yǎng)基成分的變化而顯示出巨大差異。
③要選擇合適的菌液濃度，通常菌液濃度越高，生存率越高，保存期也越長。
④最好在菌液內(nèi)不添加電解質(zhì)(如食鹽等)。
⑤可在菌液內(nèi)添加甘油等保護劑，以防止在冷凍過程中出現(xiàn)菌體大量死亡的現(xiàn)象。同樣，也可添加各種糖類、去纖維血液和脫脂牛乳等具有良好保護效果的溶劑，但對有些微生物而言，不加保護劑時更有效。
⑥原則上應盡快進行冷凍處理，但當加入保護劑時，可靜置一段時間后再進行處理。
⑦就動物細胞而言，應在-20℃范圍內(nèi)以1℃/min左右的速度緩慢降溫，此后必須盡快降到貯藏溫度；而對絕大多數(shù)微生物而言，則不必如此，如結構較為復雜的原蟲則可在-35℃范圍內(nèi)進行緩慢降溫，而噬菌體則必需采用上述的二階段法進行冷凍。
⑧若進行長期保存，則貯藏溫度越低越好。
⑨取用冷凍保存的菌種時，應采取速融措施，即在35～40℃溫水中輕輕振蕩使之迅速融解。而就厭氧菌來說，則應選擇靜置融化的措施。當冷凍菌融化后，應盡量避免再次冷凍，否則菌體的存活率將顯著下降。
常用的冷凍保存法包括：
①低溫冰箱保存法(-20℃、-50℃或-85℃)：
低溫冷凍保存時使用螺旋口試管較為方便，也可在棉塞試管外包裹塑料薄膜。保存時菌液加量不宜過多，有些可添加保護劑。此外，也可用φ5mm的玻璃珠來吸附菌液，然后把玻璃珠置于塑料容器內(nèi)，再放入低溫冰箱內(nèi)進行保存的。
②干冰保存法(-70℃左右)：
即將菌種管插入干冰內(nèi)，再置于冰箱內(nèi)進行冷凍保存；
③液氮保存法(-196℃)：
是適用范圍最廣的微生物保存法。
其操作步驟如下：
a、裝安瓶管：使用盡量濃厚的菌體懸浮于含有適當防凍劑(保存霉菌不用防凍劑)的滅菌溶液中，將0.2～1mL的這種溶液分裝于安瓶中，或在裝有分散劑的安瓶中直接接種，或?qū)⒕z體瓊脂塊直接懸浮于分散劑中。
b、熔封安瓶管：若直接貯存于氣相液氮中(-150℃～-170℃)時，則不需熔封。
c、檢查安瓶管是否熔封良好：即在4℃下，將熔封安瓶管在適當?shù)纳厝芤褐薪?～30分鐘后，觀察有無色素進入安瓶。
d、緩慢冷卻：將熔封安瓶管置于小罐中，然后用液氮氣以約1℃/min的速度冷卻至-25℃左右，也可在-20℃～-25℃的冰箱內(nèi)緩慢冷卻30～60min。
e、速冷：最后浸入液氮中快速冷卻至-196℃。
七、冷凍干燥保存法：
其原理是首先將微生物冷凍，然后在減壓下利用升華現(xiàn)象除去水分。事實上，從菌體中除去大部分水分后，細胞的生理活動就會停止，因此可以達到長期維持生命狀態(tài)的目的。該方法適用于絕大多數(shù)微生物菌種(包括噬菌體和立克次氏體等)的保存。在進行冷凍干燥時，需注意以下幾個問題：
a、冷凍干燥前的培養(yǎng)條件：首先檢驗菌種純度。一般地說，將待保存的微生物在營養(yǎng)豐富且容易增菌的培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)為宜;菌齡以達到對數(shù)生長期為好;若為有芽孢或孢子的微生物，則以芽孢和孢子形成以后進行保存為好;菌液濃度以高為好，如細菌應達到109～1010/mL。
b、菌株號碼等的標記：可在安瓶外側標記或在安瓶內(nèi)封入標簽。
c、安瓶的準備：將安瓶在2%HCl中浸泡過夜，自來水沖洗3次后，蒸餾水刷凈，干燥，塞棉塞，貼標簽，干熱滅菌或溫熱滅菌后，60℃恒溫干燥。
d、添加保護劑：常用的保護劑有脫脂乳、12%蔗糖、加7.5%葡萄糖的普通肉湯以及加7.5%葡萄糖的血清等。甘油管保藏法：在5mL菌種保藏管中，將等體積的菌懸液和40%的甘油充分混勻后，于-20℃冰箱中保存。
八、甘油管保藏法：
在5ml菌種保藏管中，將等體積的菌懸液和40%的甘油充分混勻后，于-20℃冰箱中保存。
